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PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

跨膜磷酸肌醇-3-磷酸酶張力蛋白同源物2(TPTE2)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)hnRNP A1 (K350) Antibody100 ul

IK細(xì)胞因子(IK)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)CHFR Antibody100 ul

IK細(xì)胞因子(IK)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Akt (pan) (40D4) Mouse mAb (HRP Conjugate)100 ul

IK細(xì)胞因子(IK)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)IRF-4 (D43H10) Rabbit mAb100 ul

干擾素誘導(dǎo)蛋白41(IFI41)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)PDAP1 Antibody100 ul

干擾素誘導(dǎo)蛋白41(IFI41)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)p47phox (D21F6) Rabbit mAb100 ul

干擾素誘導(dǎo)蛋白41(IFI41)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)IRF-3 (D83B9) Rabbit mAb400 ul

趨化因子C-C-基元受體樣蛋白1(CCRL1)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) Rabbit mAb (Sepharose?Bead Conjugate)100 ul
韋塞爾斯布朗病毒探針法熒光定量PCR試劑盒對硝基甲苯(standard for GC,≥99.5%(GC))48T/96THuman SLC17A5(Sialin) ELISA Kit

間硝基甲苯(Standard for GC)48T/96THuman MAGEC1(Melanoma-associated antigen C1) ELISA Kit

正壬醇(Standard for GC,≥99.5%(GC))48T/96THuman HDL(High-density lipoprotein) ELISA Kit

壬酸(Standard for GC ,>99%(GC))48T/96THuman PON2(Serum paraoxonase/arylesterase 2) ELISA Kit

硝基苯(Standard for GC,≥99.8%(GC))48T/96THuman PON3(Serum paraoxonase/lactonase 3) ELISA Kit

正辛烷(Standard for GC,≥99.5%(GC))48T/96THuman PLAC8(Placenta-specific gene 8 protein) ELISA Kit

正辛醇(Standard for GC,>99.5%)48T/96THuman RNASE7(Ribonuclease 7) ELISA Kit

正辛酸(Standard for GC,≥99.5%(GC))48T/96THuman PLEK(Pleckstrin) ELISA Kit

十八烷(Standard for GC, ≥99.5% (GC))48T/96THuman IL-37(Interleukin-37) ELISA Kit

仲辛醇(Standard for GC,≥99.5%(GC))48T/96THuman LDLR(Low-density lipoprotein receptor) ELISA Kit

二十八烷(standard for GC,≥98.5%(GC))48T/96THuman VLDLR(Very low-density lipoprotein receptor) ELISA Kit

草酸(Standard for GC,≥99.6%)48T/96THuman KRT6A(KeRatin, type II cytoskeletal 6A) ELISA Kit

丁酸丙酯(Standard for GC, ≥99.5% (GC))48T/96THuman LRP6(Low-density lipoprotein receptor-related protein 6) ELISA Kit

正丙醛(Standard for GC,>99%(GC))48T/96THuman LTC4S(Leukotriene C4 synthase) ELISA Kit

正丙胺(standard for GC,>99.5%(GC))48T/96THuman MT-CO3(Cytochrome c oxidase subunit 3) ELISA Kit

對照品糖蛋白130檢測試劑盒20mg

維生素D2（標(biāo)準(zhǔn)品） 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥99%，標(biāo)準(zhǔn)品 vitamin D2 嬰兒雙歧桿菌 Bifidobacterium infantis宇佐曲霉變種 Aspergillus usamii var.

對照品環(huán)沙星酰標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人ATP結(jié)合盒亞家族A7(ABCA7)Polyclonal Antibody 0.2ml

Human Fibrinogen like peptide 2,fgl2 ELISA Kit  人纖維介素蛋白CAS號(hào)：甜菜堿脫氫酶檢測試盒250gHuman/人Elisa試盒3300514

對照品糖化白蛋白檢測試劑盒20mg

葡萄糖鉀(AR) 質(zhì)量規(guī)格：AR Potassium-D-gluconate

對照品富馬馬斯汀標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人E3泛素蛋白連接酶AMFR (E3 ubiquitin-protein ligase AMFR)Polyclonal Antibody 0.2ml

Human Ubiquitin,Ub ELISA Kit  人泛素蛋白CAS號(hào)：5核糖激酶檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒3300514

98%500g25gD(+)木糖Mhyopneumoniae antibody IgM

N-硝基-L-精氨甲酯 質(zhì)量規(guī)格：>98% N'-Nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride

標(biāo)準(zhǔn)品,中藥標(biāo)準(zhǔn)品, Myricanol triacetate

98%5g100gD(+)木糖Chlamydia antibody IgG

 泡盛曲霉 Aspergillus awamori小鼠白血病細(xì)胞

標(biāo)準(zhǔn)品,中藥標(biāo)準(zhǔn)品, 楊梅醇

99%20mgApolipoprotein CI,APOC1 ELISA kit

AEBSF絲氨抑制劑 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR AEBSF HCl

DMEM高糖，含鈉和谷氨酰胺血小板反應(yīng)蛋白2檢測試盒20mg抗人肝病表面抗原IgG抗體檢測試盒ProstaglandinB
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。