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PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱(chēng)TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以?xún)?nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

小鼠缺血修飾白蛋白(IMA)ELISA試劑盒SimpleChIP? Human CTGF Upstream Primers100 ul

小鼠白介素7(IL-7)ELISA試劑盒 His-Tag (D3I1O) XP? Rabbit mAb (Alexa Fluor? 488 Conjugate)100 ul

小鼠白介素2受體(IL-2R)ELISA試劑盒 His-Tag (D3I1O) XP? Rabbit mAb (Alexa Fluor? 647 Conjugate)100 ul

小鼠白介素9(IL-9)ELISA試劑盒Acetyl-Histone H3 (Lys23) (D6Y7M) Rabbit mAb100 ul

小鼠白介素8(IL-8/CXCL8)ELISA試劑盒Phospho-Rpb1 CTD (Thr4) Antibody100 ul

小鼠白介素6(IL-6)ELISA試劑盒AGPAT2 (D8W9B) Rabbit mAb100 ul

小鼠白介素-5(IL-5)ELISA試劑盒Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb (PE Conjugate)100 ul

小鼠白介素4(IL-4)ELISA試劑盒Malonyl-Lysine [Mal-K] MultiMab? Rabbit mAb mix100 ul
腦膜炎奈瑟菌群探針?lè)晒舛?/font>PCR試劑盒天冬酰胺0.312-20ng/mlNPR1(Atrial natriuretic peptide receptor 1)|ANPa|ANPRA|GC-A|GUCY2A|NPRA|Pndr|ANP-A|ANPR-A|Atrial natriuretic peptide receptor type A|atrionatriuretic peptide 艾葉對(duì)照藥材15.6-1000pg/mlRELN(Reelin)|Reeler|RL

八角茴香對(duì)照藥材12.5-800pg/mlFGF8|Androgen-induced growth factor(AIGF)|Heparin-binding growth factor 8(HBGF-8)|AIGF|HBGF-8|AIGFKAL6|Androgen-induced growth factor|FGF-8|fibroblast growth factor 8

巴戟天對(duì)照品31.2-2000pg/mlPIP|GCDFP-15|GCDFP15|GPIP4|gp17|Secretory actin-binding protein(SABP)|Gross cystic disease fluid protein 15|Prolactin-induced protein|

白及對(duì)照藥材0.156-10ng/mlAIM2|Interferon-inducible protein AIM2

白術(shù)對(duì)照藥材0.156-10ng/mlKISS1R|HH8|GPR54|AXOR12|KISS-1R|HOT7T175|Metastin receptor|Kisspeptins receptor|Hypogonadotropin-1|G-protein coupled receptor 54|G-protein coupled receptor OT7T175(hOT7T175)|AXOR12|GPR54||OT7T175|AXOR12hypogonadotropin-1|GPR54kiSS-1R|KISS1 recepto

白頭翁對(duì)照藥材0.156-10ng/mlPNPLA6|NTE|Patatin-like phospholipase domain-containing protein 6

白芷對(duì)照藥材78-5000pg/mlGZMM|LMET1|MET1|Natural killer cell granular protease|Met-1 serine protease(Hu-Met-1)|Met-ase|

白茅根對(duì)照藥材0.312-20ng/mlNQO1|DTD|QR1|DHQU|DIA4|NMOR1|NMORI|Azoreductase||Diaphorase-4|Dioxin-inducible 1|Menadione Reductase|Quinone Reductase 1|DIA4azoreductase|diaphorase(NADH|NADPH)(cytochrome b-5 reductase)|dioxin-inducible 1|DT-diaphorase|NAD(P)H:menadione oxidoreductase 1|NAD(P)H:Quinone acceptor oxidoreductase type 1|NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1|diaphorase-4|Phylloquinone reductase

白蘞對(duì)照藥材0.312-20ng/mlNR1I3|CAR|CAR1|MB67|Orphan nuclear receptor MB67|Constitutive activator of retinoid response|Constitutive active response|Constitutive androstane receptor|nuclear receptor subfamily 1 group I member 3|orphan nuclear hormone receptor|Orphan nuclear receptor MB67

白薇對(duì)照藥材0.156-10ng/mlCRHBP|Corticotropin-releasing factor-binding protein|CRFBP|corticotropin releasing hormone binding protein|CRFBPcorticotropin releasing hormone-binding protein|CRF-BPCRF-binding protein|CRH-BP.

半邊蓮對(duì)照藥材1.25-80ng/mlApo M|apolipoprotein M|APOM|G3a|HSPC336|NG20|Protein G3a

半夏對(duì)照藥材0.625-40ng/mlApo D|APOD|apolipoprotein D

99%25g500ml3代坡模39809251calcitonin gene related peptide

異澤蘭黃素（標(biāo)準(zhǔn)品） 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Eupatilin

氨基端前心鈉肽(NT-ProANP)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 DCBLD2 / ESDN / CLCP1 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷(xiāo)250(g)

人白介素1可溶性受體Ⅰ(IL1sRⅠ)RFPL4B/RNF211  環(huán)指蛋白211抗體規(guī)格:96T/48TAntipyrine規(guī)格:500mgmicroRNA210檢測(cè)試盒20mg人經(jīng)典型霍奇金淋瘤細(xì)胞株，L428細(xì)胞1x10^6cells

99%100g100ml3啡酰奎尼Calcitonin

 LS 180(人結(jié)腸腺細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

氨基端前心鈉肽(NT-ProANP)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 DBH / Dopamine beta-Hydroxylase 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)1000(g)

人白介素16(IL16)RFESD  RFESD蛋白抗體規(guī)格:96T/48TApigenin規(guī)格:200mgSpondin2；mindin檢測(cè)試盒20mg人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，HUVEC細(xì)胞1x10^6cells

Fluo3五鈉鹽5mg

寶藿苷I,淫羊藿次苷II(標(biāo)準(zhǔn)品） 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Baohuoside I 小鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基許旺酵母 Schwanniomyces occidentalis

Sterile Defidrinated Chicken BloodBR酯酶Cε鏈1檢測(cè)試盒20mg催產(chǎn)素受體檢測(cè)試盒prolactin

鈣熒光探針Fluo3, AM（5mM 無(wú)水DMSO溶液）5mg

甘氨 訂購(gòu)|咨詢(xún) 規(guī)格： 100mg 鉀離子通道蛋白家族成員1樣蛋白抗體 NDN ELISA Kit Necdin蛋白(NDN)ELISA試劑盒

CD2關(guān)聯(lián)蛋白檢測(cè)試盒20mg催乳素檢測(cè)試盒Monocytechemotacticprotein1

鈣熒光探針Fluo3, AM  5mg

金0 訂購(gòu)|咨詢(xún) 規(guī)格： 20mg 驅(qū)動(dòng)蛋白家族KIF17抗體 L2HGDH ELISA Kit L-2-羥戊二脫氫酶(L2HGDH)ELISA試劑盒

Sterile Defidrinated Pig BloodBR轉(zhuǎn)化受體電位陽(yáng)離子通道亞家族C成員6檢測(cè)試盒20mg單核細(xì)胞趨化蛋白1檢測(cè)試盒cholesterol7αhydroxylase
實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專(zhuān)用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。